Auteur/autrice : galenvs

Le virus à l’origine de la COVID-19, le SRAS-CoV-2, est un type de coronavirus, une grande famille de virus portant ce nom en raison des pointes à leur surface faisant penser à une couronne. Le SRAS-CoV-2 est un grand virus d’ARN composé d’environ 30 000 nucléotides. Une caractéristique des virus ARN est leur imprécision relative dans le processus de réplication. Par conséquent, chaque nouvelle copie peut présenter des mutations stochastiques. Si la nouvelle mutation favorise le virus au sein de l’hôte ou a un avantage concurrentiel sur les autres souches déjà en circulation, elle pourrait devenir la forme dominante. C’est ce qui se passe au Royaume-Uni (UK) où un variant détecté pour la première fois le 20 septembre 2020 est apparu et est déjà la forme la plus répandue dans le pays.

À l’heure actuelle, ce nouveau variant est appelée « SARS-CoV-2 VUI 202012/01 » (c.-à-d. variant faisant l’objet d’une enquête depuis décembre 2020). Des termes comme « variant », « souche » et « mutation » sont utilisés de façon interchangeable par la presse et la communauté scientifique. Le variant est aussi souvent appelée B.1.1.7 du nom de son groupe phylogénétique distinct.

VUI 202012/01 a été identifié pour la première fois par séquençage du génome viral à Londres et dans le sud-est de l’Angleterre. Ce variant se distingue par de multiples mutations de la protéine de transitoire (délétion 69-70, délétion 144, N501Y, A570D, D614G, P681H, T716I, S982A, D1118H) ainsi que par des mutations dans d’autres régions génomiques. La mutation la plus courante de ce variant, N501Y, est sur la protéine de pointe responsable de l’infection des cellules humaines.

Pourquoi ce variant est-il plus transmissible ?

Il est fréquent de voir plusieurs variantes du même virus; c’est pourquoi nous avons un vaccin antigrippal différent chaque année. Les nouvelles souches ne signifient pas que le virus est plus nocif, et il n’y a actuellement aucune preuve que cette variante provoque une maladie plus grave ou une mortalité plus élevée. Nous savons aussi que la mortalité est un indicateur retardé, qui devra être évalué au cours des prochaines semaines. Toutefois, les données actuelles montrent que les taux d’infection dans les zones géographiques où le VUI 202012/01 circule ont augmenté plus rapidement que prévu, et la preuve de modélisation a démontré que ce variant a un taux de transmission plus élevé que les variantes répandues actuellement. Les raisons pour lesquelles cela se produit peuvent être multiples.

B.1.1.7 présente un nombre exceptionnellement élevé de mutations, en particulier sur la protéine transitoire. Trois de ces mutations ont des effets qui pourraient expliquer le taux plus élevé de transmission de la variante :

• La mutation N501Y se produit dans l’un des six principaux résidus du domaine de liaison des récepteurs (RBD) et a été décrite comme ayant une affinité de liaison croissante avec le récepteur ACE2 humain et murin (le récepteur d’entrée pour le virus).
• La délétion de protéine de pointe 69-70 del conduit à un changement conformationnel dans la protéine de pointe, qui s’avère augmenter l’évasion à la réponse immunitaire humaine.
• La mutation P681H est adjacente au site de clivage des furines S1/S2, un site où la variabilité des coronavirus est élevée.

Cette affinité globale accrue du nouveau variant pour les cellules humaines signifie que si vous respirez cette souche de la COVID-19, il y a de plus grandes chances d’infection car elle se lie plus facilement aux cellules. En outre, il semble également que ce variant est meilleure pour échapper au système immunitaire, ce qui signifie que les mécanismes de défense standard ne seront pas aussi efficaces.

Cette nouvelle souche affecte-t-elle la détection du virus ?

Certains laboratoires de diagnostic au Royaume-Uni ont signalé que la délétion 69-70del dans la protéine de spicule provoque des résultats négatifs aux tests RT-PCR pour le gène S. Cependant, les essais ciblant ce gène spécifique ne sont pas largement utilisés pour la détection primaire. Un seul essai ciblant le gène S figure sur la liste des essais publiés par l’OMS. Étant donné que les mutations sont plus susceptibles de se produire dans ce gène, il n’est pas recommandé de se fier uniquement au gène S pour la détection primaire de l’infection par le SRAS-CoV-2.

Les vaccins protégeront ils contre ce variant?

Il n’existe actuellement aucune preuve que les vaccins actuellement déployés ne protégeraient pas la population contre la nouvelle souche. Les scientifiques affirment qu’un changement dans l’efficacité des vaccins est peu probable. Cependant, il n’existe pas encore de données sur la capacité des anticorps induits par les vaccins en cours de développement à neutraliser ce variant. D’autres recherches en laboratoire sont en cours pour obtenir une caractérisation phénotypique détaillée de la nouvelle souche, et les résultats sont attendus dans les prochaines semaines.

Sources

1. https://www.ecdc.europa.eu/sites/default/files/documents/SARS-CoV-2-variant-multiple-spike-protein-mutations-United-Kingdom.pdf
2. https://virological.org/t/preliminary-genomic-characterisation-of-an-emergent-sars-cov-2-lineage-in-the-uk-defined-by-a-novel-set-of-spike-mutations/563
3. https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/transmission/variant.html
4. https://virological.org/t/preliminary-genomic-characterisation-of-an-emergent-sars-cov-2-lineage-in-the-uk-defined-by-a-novel-set-of-spike-mutations/563

Pureté, efficacité et polyvalence

Nucleic acid isolation is an essential step in molecular biology and genetic research. It involves extracting and purifying DNA or RNA from a sample of interest. Traditional nucleic acid isolation methods rely on spin-column technology, which uses silica-based columns to bind and purify nucleic acids. However, magnetic bead-based nucleic acid isolation methods have gained popularity in recent years due to their advantages over spin column methods. This article will discuss the benefits of switching from spin columns to magnetic bead-based nucleic acid isolation methods.

Speed and Efficiency

Magnetic bead-based nucleic acid isolation methods are faster and more efficient than traditional spin column methods. Magnetic beads have a larger surface area than silica-based columns, which allows for faster binding and elution of nucleic acids. Additionally, using magnetic beads allows for automation and high-throughput processing, making it ideal for laboratories that process large numbers of samples.

Increased Yield and Purity

Magnetic bead-based nucleic acid isolation methods provide higher yield and purity of nucleic acids compared to spin column methods. Magnetic beads have a high binding capacity, which ensures that all nucleic acids are captured and purified. Furthermore, magnetic bead-based methods use fewer chemicals and reagents, which reduces the risk of contamination and leads to higher purity of nucleic acids.

Versatility

Magnetic bead-based nucleic acid isolation methods are versatile and can be used for various applications, including DNA and RNA isolation, sequencing, and PCR. Using magnetic beads also allows for the isolation of nucleic acids from different sources, such as blood, tissue, and saliva. This makes it an ideal method for researchers working on various projects.

Reproducibility and Consistency

Magnetic bead-based nucleic acid isolation methods offer reproducibility and consistency in results. The use of automated magnetic bead-based systems ensures that each sample is processed in the same way, reducing the risk of experimental errors. Additionally, using standardized protocols and magnetic bead-based kits ensures that the results are consistent and reproducible.

Cost-Effective

Magnetic bead-based nucleic acid isolation methods are cost-effective in the long run. While the initial investment in magnetic bead-based systems may be higher than spin column methods, the use of magnetic beads allows for higher throughput and reduced processing time. This can lead to significant cost savings over time, especially for laboratories that process a large number of samples.

Environmentally Friendly

Magnetic bead-based nucleic acid isolation methods are more environmentally friendly than spin column methods. Magnetic beads are reusable and can be easily cleaned and sterilized, reducing the amount of waste generated. Additionally, the use of magnetic bead-based systems reduces the use of hazardous chemicals and reagents, making it a safer and more sustainable option.

In conclusion, the advantages of switching from spin column to magnetic bead-based nucleic acid isolation methods are straightforward. Magnetic bead-based methods offer faster processing time, higher yield and purity, versatility, reproducibility and consistency, cost-effectiveness, and environmental sustainability. While spin column methods have been the traditional method for nucleic acid isolation, the benefits of magnetic bead-based methods make it an attractive alternative for researchers and laboratories looking to improve their nucleic acid isolation processes.

Suite à l’annonce en août 2022 par le Département de la santé de l’État de New York de la détection du poliovirus circulant dérivé d’une souche vaccinale de type 2 (PVDVc2) dans quatre échantillons d’eaux usées et le premier cas de poliomyélite aux États-Unis depuis près d’une décennie, le point focal national RSI du Canada a signalé la détection de PVDVc2 dans deux échantillons d’eaux usées collectés au Canada au cours du même mois.

Selon le rapport du  Pan American Health Organization (PAHO) publié le 30 décembre 2022, cette souche de virus a été trouvée dans des échantillons collectés entre le 20 et le 30 août dans les communautés connectées à l’État de New York. Aucun cas suspecté ou confirmé de paralysie flasque aiguë, le syndrome le plus courant causé par la poliomyélite, n’a été signalé dans les régions où les échantillons d’eaux usées canadiens ont été prélevés.

En réponse, l’Agence de la santé publique du Canada a annoncé des plans pour lancer des tests et une surveillance des eaux usées pour le virus. Cela fait près de 30 ans que le Canada n’a signalé aucun cas de poliomyélite. Le laboratoire national de microbiologie du Canada, qui a collecté les spécimens au Canada, n’a pas trouvé de traces du virus dans les échantillons d’eaux usées collectés entre le 31 octobre et le 9 novembre. Cependant, le laboratoire continuera à tester des échantillons archivés de septembre et décembre provenant des sites ciblés.

Qu’est-ce qu’un poliovirus dérivé d’un vaccin ?

Un poliovirus dérivé d’un vaccin (PVDV) est une souche apparentée au poliovirus vivant affaibli contenu dans le vaccin antipoliomyélitique oral (VPO). Si on le laisse circuler suffisamment longtemps dans des populations sous- ou non vaccinées, ou s’il se réplique chez un individu immunodéficient, le virus affaibli peut revenir à une forme qui provoque la maladie et la paralysie.

Le VPO est un vaccin sûr et efficace qui contient une combinaison d’une, deux ou trois souches de poliovirus vivants et affaiblis, et qui est administré sous forme de gouttes orales. Le VPO a contribué à l’éradication des poliovirus sauvages dans de nombreux pays, car il arrête la propagation du virus en induisant une immunité dans l’intestin. Les PVDV apparaissent lorsqu’un nombre insuffisant de personnes sont vaccinées contre la polio, et que la souche affaiblie du poliovirus issue du VPO se propage parmi les populations sous-immunisées.

D’où viennent les poliovirus dérivés de vaccins (PVDV) ?

Les PVDV peuvent provoquer des épidémies dans les endroits où la couverture vaccinale est faible. En outre, les personnes atteintes de certains troubles de l’immunodéficience peuvent excréter le virus pendant de longues périodes, au cours desquelles le virus peut continuer à se transformer et infecter une personne non vaccinée.

Selon les Centres de contrôle et de prévention des maladies des États-Unis, la vaccination contre la polio protège les personnes contre les poliovirus et les PVDV d’origine naturelle. Continuer à atteindre une couverture vaccinale VDPV élevée est le meilleur moyen de maintenir un pays sans polio et de prévenir les importations du virus. En outre, l’accès à l’eau potable, de bonnes habitudes d’hygiène des mains, des systèmes d’égouts modernes et la gestion des eaux usées empêchent davantage les germes, y compris les virus comme le poliovirus, de se propager.

La détection et le diagnostic des agents pathogènes animaux dans l’industrie vétérinaire est un aspect essentiel des soins aux animaux. Qu’il s’agisse d’une simple infection respiratoire ou d’une maladie plus grave et potentiellement mortelle, l’identification rapide et précise du problème est essentielle au succès du traitement et à la guérison des animaux affectés. Dans cet article, nous allons explorer trois raisons pour lesquelles il est si important de détecter les agents pathogènes animaux aussi rapidement et précisément que possible dans l’industrie vétérinaire.

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Amélioration des résultats du traitement et de la récupération
L’une des principales raisons de l’importance d’une détection précise et rapide des agents pathogènes animaux est le potentiel d’amélioration des résultats du traitement et de la récupération des animaux affectés. De nombreux agents pathogènes vétérinaires peuvent provoquer des maladies graves et évolutives qui peuvent mettre la vie en danger si elles ne sont pas traitées. En identifiant la présence d’un agent pathogène dès le début, les vétérinaires peuvent mettre en œuvre des protocoles de traitement appropriés qui peuvent aider à atténuer l’impact de la maladie et à améliorer les chances de succès. Ceci est particulièrement important dans les cas où l’agent pathogène est très virulent ou la maladie progresse rapidement, car un retard dans le diagnostic et le traitement peut réduire considérablement les chances d’un résultat positif.

Prévention de la transmission des maladies
Une autre raison importante pour une détection précise et rapide des agents pathogènes animaux est la prévention de la transmission des maladies. De nombreux agents pathogènes vétérinaires sont très contagieux et peuvent facilement être transmis d’un animal à un autre, soit directement par contact, soit indirectement par l’environnement. Cela peut entraîner la propagation de maladies au sein des populations animales, entraînant potentiellement des foyers et des épidémies. En détectant et en diagnostiquant la présence d’un agent pathogène à un stade précoce, les vétérinaires peuvent prendre des mesures pour isoler les animaux affectés et prévenir la transmission ultérieure de la maladie. Ceci est particulièrement important dans les cas où l’agent pathogène est hautement contagieux ou a le potentiel de se propager rapidement au sein d’une population.

Amélioration du bien-être animal
Un diagnostic précis et rapide est également essentiel pour le bien-être des animaux atteints. De nombreuses maladies et affections vétérinaires peuvent causer des douleurs et des souffrances importantes à l’animal, et une détection et un traitement précoces peuvent aider à atténuer ces souffrances. En outre, un diagnostic précoce peut également aider à prévenir le développement de complications pouvant survenir à la suite de la maladie ou de l’affection. Ceci est particulièrement important dans les cas où l’animal présente des symptômes graves ou risque de développer des complications qui pourraient avoir un impact significatif sur sa qualité de vie.

Il existe une variété d’outils et de techniques de diagnostic que les vétérinaires peuvent utiliser pour détecter avec précision les agents pathogènes animaux. Ceux-ci peuvent inclure un examen physique, des tests de laboratoire, une radiologie, une endoscopie et une biopsie. L’approche spécifique dépendra de l’agent pathogène et de la maladie spécifiques considérés, ainsi que des besoins et des circonstances uniques de chaque animal. En utilisant une combinaison de ces techniques, les vétérinaires peuvent détecter et diagnostiquer avec précision un large éventail d’agents pathogènes vétérinaires, ce qui leur permet de fournir les meilleurs soins possibles à leurs patients.

En conclusion, la détection précise et rapide des agents pathogènes animaux est essentielle pour le succès du traitement et de la récupération des animaux affectés, la prévention de la transmission des maladies et le bien-être des animaux affectés. En utilisant une gamme d’outils et de techniques de diagnostic, les vétérinaires peuvent identifier avec précision la présence d’agents pathogènes dans les échantillons d’animaux, ce qui leur permet de fournir les meilleurs soins possibles à leurs patients et de prévenir la propagation des maladies au sein des populations animales.

Comprendre le problème et explorer les solutions

La résistance aux antimicrobiens (RAM) est une menace mondiale pour la santé et le bien-être des animaux, ainsi que pour la sécurité alimentaire. L’utilisation d’antibiotiques dans l’industrie animale a contribué à l’émergence et à la propagation de bactéries résistantes, ce qui rend plus difficile le traitement des maladies infectieuses chez les animaux et les humains. Dans cet article, nous examinerons la situation actuelle de la RAM dans l’industrie animale, son impact et les mesures qui peuvent être prises pour atténuer le problème.

Une préoccupation croissante

La résistance aux antimicrobiens est une préoccupation croissante dans l’industrie animale, et les taux de résistance sont en augmentation. Selon une étude de l’Organisation mondiale de la santé animale (OIE), l’utilisation d’antimicrobiens chez le bétail devrait augmenter de 67 % d’ici à 2030, ce qui aggravera encore le problème de la RAM (OIE, 2020). En outre, les données de l’Union européenne montrent qu’un pourcentage élevé de bactéries isolées d’animaux producteurs d’aliments sont résistantes aux antimicrobiens (ECDC/EFSA/EMA, 2020).

Impact de la RAM sur l’industrie animale

L’impact de la RAM sur l’industrie animale est multiforme. Elle affecte la santé et le bien-être des animaux, l’environnement et la sécurité alimentaire. Les bactéries résistantes peuvent provoquer chez les animaux des infections difficiles à traiter, entraînant des souffrances prolongées et une augmentation des taux de mortalité (OMS, 2018). En outre, la propagation de la RAM peut contaminer l’environnement et les produits alimentaires, ce qui constitue un risque pour la santé publique. On estime que les coûts économiques de la RAM dans l’industrie animale atteindront 6,5 milliards de dollars par an d’ici 2050 (O’Neill, 2014).

Comment identifier la résistance aux antimicrobiens

L’identification de la résistance aux antimicrobiens (RAM) est une étape essentielle pour lutter contre sa propagation dans l’industrie vétérinaire. Certaines des méthodes utilisées pour identifier la RAM chez les animaux sont les suivantes :

1. Test de sensibilité aux antimicrobiens

Les tests de sensibilité aux antimicrobiens (AST) consistent à tester la capacité des bactéries à se développer en présence d’antibiotiques. Cela peut se faire par différentes méthodes, notamment la diffusion sur disque, la microdilution en bouillon et les systèmes automatisés. Les résultats de l’AST peuvent aider à déterminer la sensibilité des bactéries à différents antibiotiques et à choisir le traitement approprié.

2. Méthodes moléculaires

Les méthodes moléculaires, telles que la réaction en chaîne par polymérase (PCR) et le séquençage du génome entier, peuvent être utilisées pour identifier les gènes de résistance dans les isolats bactériens. Ces méthodes peuvent fournir des informations sur la base génétique de la résistance et aider à identifier les schémas de résistance émergents.

3. Programmes de surveillance

Des programmes de surveillance peuvent être mis en place pour suivre la prévalence et la distribution des bactéries résistantes chez les animaux, dans les produits alimentaires et dans l’environnement. Ces programmes peuvent impliquer la collecte et l’analyse de données provenant de différentes sources, notamment des échantillons d’animaux, des produits alimentaires et des eaux usées.

4. Signes cliniques d’échec du traitement

Les signes cliniques de l’échec du traitement peuvent également être une indication de la RAM chez les animaux. Si un animal ne répond pas au traitement antibiotique comme prévu, cela peut indiquer la présence de bactéries résistantes. Dans ce cas, d’autres tests, tels que l’AST ou les méthodes moléculaires, peuvent être nécessaires pour confirmer la présence d’une résistance.

Mesures pour atténuer la RAM dans l’industrie animale

Plusieurs mesures peuvent être prises pour atténuer le problème de la RAM dans l’industrie animale. Il s’agit notamment de :

• Réduire l’utilisation des antimicrobiens dans la production animale

L’utilisation d’antibiotiques dans l’industrie animale devrait être réduite au minimum et des approches alternatives de prévention et de contrôle des maladies devraient être encouragées. Par exemple, la vaccination, l’amélioration de l’hygiène et les mesures de biosécurité peuvent contribuer à réduire le besoin d’antimicrobiens.

• Mettre en œuvre une utilisation responsable des antimicrobiens

Lorsque des antimicrobiens sont utilisés, il est essentiel de les utiliser de manière responsable. Il s’agit notamment de veiller à ce que les antibiotiques ne soient utilisés que lorsque cela est nécessaire, de les utiliser à la bonne dose et pendant la bonne durée, et d’éviter l’utilisation d’antimicrobiens d’importance critique.

• Surveillance et suivi de la résistance

Surveillance programs can be set up to monitor the prevalence and distribution of resistant bacteria in animals, food products and the environment. Cela peut permettre d’identifier les schémas de résistance émergents et d’orienter le choix du traitement approprié.

• Éducation et sensibilisation

Des campagnes d’éducation et de sensibilisation peuvent promouvoir l’utilisation responsable des antimicrobiens dans l’industrie animale. Il peut s’agir de fournir des informations aux agriculteurs, aux vétérinaires et aux autres parties prenantes sur les risques de la RAM, les approches alternatives de prévention et de contrôle des maladies, et l’importance d’une utilisation responsable des antimicrobiens.

En conclusion, l’utilisation excessive et abusive d’antibiotiques dans la production animale a contribué à l’émergence et à la propagation de bactéries résistantes aux antibiotiques. La résistance aux antimicrobiens constitue un défi important pour l’industrie animale, et son impact est considérable. Il est possible de ralentir la RAM et de protéger la santé et le bien-être des animaux ainsi que la sécurité alimentaire en identifiant les schémas de résistance et en y réagissant sur temps, ainsi que une utilisation plus responsable des antimicrobiens. Il s’agit d’un problème critique qui doit être traité immédiatement avant qu’il ne devienne une menace beaucoup plus grave à l’avenir.

Que sont les Exosomes ?
Les exosomes sont des vésicules extracellulaires qui contiennent plusieurs composants cellulaires, notamment des protéines, de l’ADN et de l’ARN. La fusion de la membrane plasmique avec des corps multivésiculaires (MVB) produit des exosomes (Figure 1). Ces vésicules sont principalement libérées par une cellule pour communiquer ou interagir avec les cellules voisines en délivrant des informations au sein de l’ADN et de plusieurs types d’ARN, par exemple, microARN, ARNm. De plus, la protéine contenue dans les exosomes peut interagir avec le processus cellulaire de la cellule réceptrice. Par conséquent, il est important d’identifier les informations au sein de l’exosome pour étudier le processus cellulaire. En particulier, la caractérisation de l’exosome devient une bonne technique pour étudier le cancer métastatique (Zhu et al., 2020). Leurs biomarqueurs spécifiques aux cellules dont ils sont issus peuvent également être utiles à des fins de diagnostic (McNicholas et al., 2017).

Figure 1 : Formation d’exosomes dans la cellule (Than, Guanzon, Leavesley et Parker, 2017).

Plusieurs méthodes peuvent être utilisées pour séparer l’exosome d’un fluide corporel (Figure 2), tandis que la plupart des méthodes de séparation des exosomes sont basées sur la technique d’ultra-centrifugation (UC) (Brennan et al., 2020). Certaines des méthodes d’isolement d’exosome sont résumées ici :

Isolation basée sur l’ultracentrifugation : les exosomes peuvent être séparés par une série de techniques de centrifugation, en éliminant les composants inutiles tels que les cellules et les débris cellulaires. Ces centrifugations fourniront un surnageant d’exosomes. Enfin, l’ultracentrifugation fournira un culot d’exosomes. Mais il est très important de laver les exosomes granulés avec des milieux de culture cellulaire ou du PBS au moins une fois pour les purifier. Il est également important d’effectuer toutes les étapes de centrifugation à 4°C afin de maintenir les protéases, DNases et RNases inactives.

Ultracentrifugation avec des gradients de densité de saccharose : Pour cette technique, le culot d’exosome sera ensuite centrifugé à 100 000–200 000 x G pendant 120 min dans un milieu à gradient de saccharose. Les exosomes devraient flotter à des densités de saccharose allant de 1,15 à 1,19 g/mL sur des gradients continus de saccharose. Bien que cette méthode fournisse un exosome hautement purifié, elle prend du temps et demande beaucoup de travail. De plus, la configuration de la vitesse et du temps de centrifugation nécessite des personnels très expérimentés.

Figure 2 : Résumé schématique de l’isolement des exosomes à l’aide de cinq méthodes différentes à partir de sérum humain et d’analyses en aval. Avec Western blot (WB) ou analyse de suivi des nanoparticules (NTA) (Brennan et al., 2020).

Ultracentrifugation en coussin (CUC) : l’échantillon de sérum doit être dilué dans 4,6 ml de PBS et 0,4 ml de 40 % d’iodixanol-PBS pour une ultracentrifugation à 120 000 g pendant 2 heures à 4 °C. Après centrifugations, le culot d’exosome nécessite une remise en suspension dans 50 à 100 µl de PBS résiduel pour CUC.

Isolation basée sur la chromatographie d’exclusion de taille (SEC) : il s’agit d’une méthode d’ultrafiltration plus rapide que l’ultracentrifugation, bien que les exosomes puissent s’agréger et obstruer les pores du gel, ce qui entraîne un faible rendement. En outre, la contamination par l’ARN non exosomal est également un problème pour l’utilisation de cette technique. Par conséquent, il nécessite une étape de lavage après chaque étape de filtration pour améliorer la récupération des exosomes. Un concentrateur de nanofiltration pourrait être utile pour un enrichissement rapide des exosomes avec de courtes périodes de centrifugation (Ludwig, Razzo, Yerneni et Whiteside, 2019).

Isolation basée sur la précipitation : les exosomes peuvent facilement précipiter dans plusieurs solutions de polymères excluant le volume, par exemple le polyéthylène glycol. Si l’échantillon incube pendant la nuit avec du polyéthylène glycol à 4 ° C, la centrifugation à basse vitesse fournit un culot d’exosome. De plus, les lectines pourraient être utiles pour agglutiner les exosomes et les agglomérer à une vitesse centrifuge relativement faible (Chang, Chang, Chao et Yu, 2018).

Isolement basé sur l’immuno-affinité : les exosomes contiennent un grand nombre de protéines, y compris des récepteurs cellulaires à leur surface. Cela leur permet de se lier avec des anticorps spécifiques à leurs aptamères. Des anticorps spécifiques aux marqueurs de protéines exosomales, tels que Hsp70, CD9, CD63, CD81, CD82, Rab-5b et TSG101 sont utilisés pour cette technique pour sélectionner l’exosome souhaité ou pour piéger l’exosome indésirable. Après piégeage de l’exosome avec un anticorps anti-marqueur spécifique, ces anticorps peuvent s’immobiliser sur des plaques ELISA, des billes magnétiques et de chromatographie (Cai et al., 2018), ou les utiliser dans des dispositifs microfluidiques.

En utilisant l’immunopartialité basée sur des billes magnétiques, ces sous-ensembles peuvent être spécifiquement capturés et examinés à l’aide de la cytométrie en flux ou éventuellement de la microscopie électronique. Pour que les exosomes servent de marqueur, les vésicules doivent être améliorées et spécialement fractionnées. Amélioration des exosomes en grande partie réalisée par ultracentrifugation et régulièrement en mélange avec l’inclinaison de l’épaisseur du saccharose. Il sépare les sous-populations d’exosomes si elles sont présentes. Les protéines CD9 et CD81 sont des marqueurs extracellulaires normaux qui peuvent être utilisés pour des captures spécifiques. Les billes de latex pour une capture spécifique nécessitent plusieurs étapes de centrifugation, ce qui pose un défi. Les billes magnétiques de taille nanométrique sont une alternative aux billes de latex pour la capture des exosomes, détachant une population plus homogène de vésicules concernant

La magnétofection, également connue sous le nom de transfection magnétique, est une procédure dans laquelle l’acide nucléique est lié aux nanoparticules magnétiques (MNP) suivies de leur livraison dans les cellules eucaryotes par l’application de la force magnétique. Les nanoparticules magnétiques sont habituellement constituées d’oxyde de fer et dégradées dans les cellules vivantes, ne présentant donc aucun danger pour les cellules. Cette technique a des applications plus larges dans la recherche moléculaire, la biologie cellulaire et les applications thérapeutiques potentielles (1).

Comment fonctionne la magnétofection

Dans la magnétofection, les acides nucléiques sont d’abord liés aux MNP, suivis de leur distribution dans les cellules eucaryotes à l’aide d’un champ magnétique. La liaison des acides nucléiques [acide désoxyribonucléique (ADN) et acide ribonucléique (ARN)] aux MNP est facilitée par des interactions électrostatiques. L’ADN et l’ARN ont des charges de surface négatives et sont attirés vers des matériaux positifs (cationiques) à la surface des MNP. Les expériences in vitro et in vivo ont prouvé que les molécules d’acide nucléique liées aux MNP sont transférées à l’intérieur de la cellule par magnétofection de manière très efficace (2).

Avantages de la magnétofection par rapport aux autres méthodes de transfection

La transfection est une procédure pour délivrer des acides nucléiques à l’intérieur des cellules eucaryotes en utilisant des méthodes physiques ou chimiques. Le transfert d’acides nucléiques par vecteurs viraux dans les cellules est classé comme transduction; cependant, leur distribution est parfois assurée par des méthodes de transfection. La magnétofection, y compris plusieurs autres méthodes comme la microinjection, la sonoporation, l’électroporation, le pistolet à gènes, la nucléosection, les micronésules et la magnétoporation, entrent dans la catégorie des méthodes physiques. Les méthodes de transfection chimique sont principalement à base de lipides ou de polymères. Plusieurs modifications des méthodologies chimiques telles que les nanoparticules, les points quantiques et l’administration d’acide nucléique à médiation graphène avec des nanoparticules de silice ou des nanotubes de carbone sont également utilisées dans certains protocoles. Cependant, parmi toutes ces méthodes, la magnétofection est relativement plus simple d’utilisation, efficace dans la livraison d’acide nucléique et économique par rapport à toutes les autres méthodologies qui impliquent des équipements sophistiqués et des formulations complexes.

La livraison d’acides nucléiques libres ou de gènes thérapeutiques contenant des vecteurs dans les cellules/tissus eucaryotes est assez difficile. Dans les environnements intracellulaires, les enzymes dégradantes empêchent l’apport de matériel génétique thérapeutique à l’intérieur des cellules/tissus. La magnétofection a été reconnue comme l’un des outils les plus puissants pour fournir des acides nucléiques intacts/fonctionnels et des vecteurs contenant du matériel génétique spécifique utilisé, ayant ainsi le potentiel de corriger le gène dysfonctionnel (3).

Supposons que la magnétofection est utilisée pour la livraison de l’ARN. Dans ce cas, il devrait être transféré dans le cytoplasme cellulaire pour l’expression. En revanche, l’ADN pénètre d’abord dans le noyau, puis forme l’ARN messager qui sort vers le cytoplasme pour exprimer le produit désiré.

Plusieurs rapports scientifiques ont fourni une preuve de concept sur la supériorité de la magnétofection par rapport à d’autres procédures de transfection. Selon une étude in vitro de transfert de gène dans les cellules microgliales qui protègent notre cerveau, la magnétofection a transféré efficacement le matériel génétique par rapport aux méthodologies conventionnelles de transfert de gène (4).

Progrès récents en matière de magnétofection :

La magnétofection a de nombreuses applications dans les protocoles de thérapie génique dans lesquels les gènes défectueux sont remplacés par des gènes sains dans les cellules/tissus humains. Par rapport à d’autres protocoles, la transmission de gènes saints par magnétofection dans les cellules humaines est considérée comme la plus prometteuse. Cependant, des recherches sont en cours pour développer une formulation appropriée et des compétences appropriées en matière de champ magnétique. La thérapie génique par magnétofection à des fins thérapeutiques en plus de l’administration ciblée offre l’avantage unique d’être moins invasive (5).

Le transfert d’acide nucléique par nanoparticules magnétiques dans les cellules souches (6) et la souplesse de la méthodologie (7) ajoutent à sa polyvalence pour son utilisation extensive en médecine régénérative et en maladies génétiques.

La magnétofection dans la pratique clinique

Il est devenu un fait que la magnétofection, si elle est correctement utilisée, pourrait transférer efficacement des acides nucléiques ainsi que des gènes thérapeutiques contenant des vecteurs viraux dans les cellules/tissus humains. Cependant, son développement pour l’utilisation clinique est entravé en raison de la nature chimique du devenir des MNP in vivo. Des recherches sont en cours sur la bioévaluation des MNP pour leur utilisation clinique potentielle dans les protocoles de thérapie génique impliquant la magnétofection (8). En ce qui concerne les applications cliniques de la magnétofection, l’administration ciblée dans les tissus cancéreux pour contrôler plusieurs types de cancer est très prometteuse (9).

Sources:

1. Plank C, Anton M, Rudolph C, Rosenecker J, Krotz F. Enhancing and targeting nucleic acid delivery by magnetic force. Expert Opin Biol Ther. 2003;3(5):745-58.
2. Bi Q, Song X, Hu A, Luo T, Jin R, Ai H, et al. Magnetofection: Magic magnetic nanoparticles for efficient gene delivery. Chinese Chemical Letters – doi: https://doiorg/101016/jcclet202007030. 2020.
3. Scherer F, Anton M, Schillinger U, Henke J, Bergemann C, Kruger A, et al. Magnetofection: enhancing and targeting gene delivery by magnetic force in vitro and in vivo. Gene Ther. 2002;9(2):102-9.
4. Smolders S, Kessels S, Smolders SM, Poulhes F, Zelphati O, Sapet C, et al. Magnetofection is superior to other chemical transfection methods in a microglial cell line. J Neurosci Methods. 2018;293:169-73.
5. Qunjie B, Song X, Hu A, Luo T, Jin R, Ai H, et al. Magnetofection: Magic magnetic nanoparticles for efficient gene delivery[J]. . Chinese Chemical Letters. 2020;31(12):3041-6.
6. Yamoah MA, Thai PN, Zhang X. Transgene Delivery to Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Nanoparticles. Pharmaceuticals. 2021;14(4):334.
7. Blokpoel Ferreras LA, Chan SY, Vazquez Reina S, Dixon JE. Rapidly Transducing and Spatially Localized Magnetofection Using Peptide-Mediated Non-Viral Gene Delivery Based on Iron Oxide Nanoparticles. ACS Appl Nano Mater. 2021;4(1):167-81.
8. Dragar C, Kralj S, Kocbek P. Bioevaluation methods for iron-oxide-based magnetic nanoparticles. Int J Pharm. 2021;597:120348.
9. Belete TM. The Current Status of Gene Therapy for the Treatment of Cancer. Biologics. 2021;15:67-77.

La complexité biologique et les défis liés à son élucidation

Les organismes biologiques sont des systèmes complexes composés de divers types de cellules et de tissus.¹ Pour élucider les processus physiologiques et physiopathologiques qui se produisent dans les systèmes biologiques, les études de recherche devraient tenir compte de leur complexité. Cependant, de nombreux paradigmes expérimentaux traditionnels ne permettent pas d’évaluer correctement cette complexité biologique ou ne permettent pas une évaluation rapide et évolutive. Les billes magnétiques à code-barre moléculaire sont l’une des pistes de recherche sur cette complexité biologique.

Les billes à codes-barres moléculaires et leurs applications

Les billes à code-barres moléculaires sont étiquetées avec des codes uniques (molécules) qui permettent l’évaluation à une seule cellule. Le nombre de codes varie en fonction du test utilisé et peut inclure le marquage fluorescent, chimique, électronique ou graphique. Les billes à codes-barres moléculaires facilitent l’identification des lectures provenant de cellules individuelles. Dans le contexte des systèmes microfluidiques, elles permettent la flexibilité, la sensibilité et l’analyse à haut débit. Par conséquent, les billes à codes barres ont trouvé des applications dans les essais biologiques multiplex dans les domaines du diagnostic moléculaire, du développement de biomarqueurs, de l’analyse de l’hétérogénéité tumorale, de la pharmacogénomique, de la compréhension de la complexité des tissus et de l’analyse mutationnelle des gènes. 

Billes à code barres oligonucléotidiques

Les oligonucléotides sont l’un des types de codes-barres moléculaires des billes. Macosco et al. (2015) ont décrit la conception des billes oligonucléotidiques à code à barres utilisées avec la méthode de Drop-Seq. ² Les auteurs ont synthétisé des amorces oligonucléotidiques sur les billes dans la direction 5 à 3, ce qui laisse libre trois extrémités disponibles pour l’amorçage enzymatique. Les étiquettes d’oligonucléotides se composent de quatre parties : une séquence constante, un « code-barre de cellules », un identificateur moléculaire unique et une séquence de capture et d’amorçage d’oligo-dT. La séquence constante sert de site d’amorçage pour la PCR en aval et le séquençage. Le « code barre des cellules » est identique à la surface de chaque bille sur tous les apprêts, mais diffère des codes barres des cellules présents sur les autres billes. L’identificateur moléculaire unique diffère d’une amorce à l’autre et permet d’identifier les duplicatas de PCR3. Enfin, la séquence oligo-dT est responsable de la capture des ARNm polyadénaturés et de l’amorçage de la transcription inversée2.

Billes Oligo nucléotidiques avec code barre dans le cadre de la technologie du Drop-Sequencing

Lorsque des billes à codes-barres moléculaires sont appliquées dans le contexte du séquençage, elles permettent de tracer la séquence jusqu’aux cellules individuelles. La technologie Drop-Seq est un système expérimental à base microfluidique, dans lequel les billes étiquetées avec des oligonucléotides facilitent la récupération des transcriptomes unicellulaires.4 À l’aide d’un dispositif microfluidique, les cellules individuelles sont encapsulées avec des billes à code barre et un tampon de lyse dans des gouttelettes aqueuses. Après l’encapsulation, les cellules sont lysées, et l’ARNm est libéré et hybridé aux étiquettes oligonucléotidiques des billes. Par la suite, les gouttelettes sont regroupées et cassées, et les billes sont relâchées. Les ARNm unicellulaires capturés sur les billes isolées sont ensuite soumis à une transcription inversée avec changement de modèle. Les ADNc sont générés et amplifiés, et des adaptateurs de séquençage sont ajoutés. Enfin, les échantillons d’ARNm générés peuvent être séquencés.2,4  

Plus récemment, des méthodes pour l’identification et la correction des erreurs de codes-barres moléculaires sur les billes ont été identifiées, y compris la circularisation de la séquence d’ARN.5

Dans l’ensemble, la méthode Drop-Seq qui utilise des billes à codes-barres oligonucléotidiques,  analyse non seulement les transcriptions d’ARNm de milliers de cellules individuelles, mais enregistre également leurs cellules d’origine. Ainsi, la méthode permet une analyse transcriptomique monocellulaire à haut débit, ce qui facilite l’élucidation de la complexité biologique. 

Sources: 

1. Lobo, I. Biological complexity and integrative levels of organization. Nature Educ. 2008;1(1):141. 
2. Macosko EZ, Basu A, Satija R, Nemesh J, Shekhar K, Goldman M, Tirosh I, Bialas AR, Kamitaki N, Martersteck EM, Trombetta JJ, Weitz DA, Sanes JR, Shalek AK, Regev A, McCarroll SA. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter d Cell. 2015;161(5):1202-1214. 
3. Kivioja T, Vähärautio A, Karlsson K, Bonke M, Enge M, Linnarsson S, Taipale J. Counting absolute numbers of molecules using unique molecular identifiers. Nat Methods. 2011 Nov 20;9(1):72-74. 
4. https://www.dolomite-bio.com/how-it-works/drop-seq/ 
5. Tambe A, Pachter L. Barcode identification for single cell genomics. BMC Bioinformatics. 2019;20(1):32.