Les techniques de diagnostic moléculaire utilisant des acides nucléiques ont été mises au point grâce à la réaction en chaîne par polymérase (PCR), qui est la technique prédominante en raison de sa familiarité, de sa sensibilité et de sa robustesse.
Que signifie « PCR » et pourquoi tout le monde en parle ?
La réaction en chaîne par polymérase (PCR) est une technique utilisée pour « amplifier » ou faire de nombreuses copies de petits segments d’ADN, permettant aux scientifiques de faire des recherches génétiques approfondies et aux cliniciens de détecter une variété de maladies. Cette méthode est extrêmement utile dans le diagnostic des troubles génétiques, la prise d’empreintes génétiques et la détection de virus ou de bactéries. Pourtant, l’utilisation croissante des techniques de diagnostic moléculaire a souligné la simplicité et la vitesse comme facteurs clés pour l’adoption de différentes méthodes, en particulier dans les paramètres de diagnostic à petite échelle.
Pour les applications sur le terrain et au point de service, les techniques d’amplification isotherme pourraient remplir avec succès ces critères. Dans les méthodes d’amplification isotherme, il n’y a pas besoin d’équipement de cycle thermique coûteux. En fait, ces méthodes ne nécessitent qu’une seule température. Par conséquent, les réactions d’amplification pourraient être accomplies en seulement 5 minutes.
Applications des techniques d’amplification isotherme
L’amplification isotherme à médiation par boucle (LAMP) est la méthode isotherme la plus répandue. Elle est appliquée aux diagnostique pour la détection d’agents pathogènes dans les aliments, les animaux, les végétaux et les échantillons cliniques. Par exemple, en 2011, Zhang et ses collègues ont utilisé LAMP pour détecter les Salmonella spp. avec une sensibilité élevée dans les légumes. L’année suivante, Wang et ses collègues ont analysé la toxine shiga produisant E. coli (STEC) à l’aide de tests LAMP pour le bœuf haché, les épinards, les parures de bœuf et la laitue.
Le principe de l’amplification isotherme à médiation par boucle
LAMP, qui se base sur le déplacement automatique des brins d’ARN ou d’ADN, se compose de deux étapes principales :
- Dans la première étape, quatre amorces sont spécialement conçues pour former une structure en forme d’haltère.
- Dans la deuxième étape, cette structure en forme d’haltère est utilisée comme modèle pour d’autres cycles d’amplification qui procèdent à la synthèse d’ADN amorcée avec les deux amorces internes.
Les deux amorces internes de LAMP sont conçues de manière à former une structure en boucle chaque fois qu’un seul brin est produit. Ces deux amorces internes se composent de deux ensembles de séquences qui peuvent lier à la fois les brins sensoriels et antisens, avec un espaceur TTTT entre les ensembles de séquence.
Les deux amorces extérieures aident à initier la synthèse d’ADN / ARN de déplacement de brin pour faire la structure de boucle à une extrémité. Pour améliorer la vitesse de réaction, deux amorces optionnelles, LF (boucle avant) et LB (boucle arrière), peuvent également être ajoutées à la réaction d’amplification.
Les avantages de LAMP
Sources:
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Zhang, Guodong, Eric W. Brown, and Narjol González-Escalona. « Comparison of real-time PCR, reverse transcriptase real-time PCR, loop-mediated isothermal amplification, and the FDA conventional microbiological method for the detection of Salmonella spp. in produce. » Applied and environmental microbiology 77.18 (2011): 6495-6501.
Wang, Fei, et al. « Rapid and specific detection of Escherichia coli serogroups O26, O45, O103, O111, O121, O145, and O157 in ground beef, beef trim, and produce by loop-mediated isothermal amplification. » Applied and environmental microbiology 78.8 (2012): 2727-2736
Zhang, Wei, et al. « Application of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay for the rapid diagnosis of pathogenic bacteria in clinical sputum specimens of acute exacerbation of COPD (AECOPD). » International journal of clinical and experimental medicine 8.5 (2015): 7881.
