Billes magnétiques à code-barre moléculaire 

La complexité biologique et les défis liés à son élucidation

Les organismes biologiques sont des systèmes complexes composés de divers types de cellules et de tissus.¹ Pour élucider les processus physiologiques et physiopathologiques qui se produisent dans les systèmes biologiques, les études de recherche devraient tenir compte de leur complexité. Cependant, de nombreux paradigmes expérimentaux traditionnels ne permettent pas d’évaluer correctement cette complexité biologique ou ne permettent pas une évaluation rapide et évolutive. Les billes magnétiques à code-barre moléculaire sont l’une des pistes de recherche sur cette complexité biologique.

Les billes à codes-barres moléculaires et leurs applications

Les billes à code-barres moléculaires sont étiquetées avec des codes uniques (molécules) qui permettent l’évaluation à une seule cellule. Le nombre de codes varie en fonction du test utilisé et peut inclure le marquage fluorescent, chimique, électronique ou graphique. Les billes à codes-barres moléculaires facilitent l’identification des lectures provenant de cellules individuelles. Dans le contexte des systèmes microfluidiques, elles permettent la flexibilité, la sensibilité et l’analyse à haut débit. Par conséquent, les billes à codes barres ont trouvé des applications dans les essais biologiques multiplex dans les domaines du diagnostic moléculaire, du développement de biomarqueurs, de l’analyse de l’hétérogénéité tumorale, de la pharmacogénomique, de la compréhension de la complexité des tissus et de l’analyse mutationnelle des gènes. 

Billes à code barres oligonucléotidiques

Les oligonucléotides sont l’un des types de codes-barres moléculaires des billes. Macosco et al. (2015) ont décrit la conception des billes oligonucléotidiques à code à barres utilisées avec la méthode de Drop-Seq. ² Les auteurs ont synthétisé des amorces oligonucléotidiques sur les billes dans la direction 5 à 3, ce qui laisse libre trois extrémités disponibles pour l’amorçage enzymatique. Les étiquettes d’oligonucléotides se composent de quatre parties : une séquence constante, un « code-barre de cellules », un identificateur moléculaire unique et une séquence de capture et d’amorçage d’oligo-dT. La séquence constante sert de site d’amorçage pour la PCR en aval et le séquençage. Le « code barre des cellules » est identique à la surface de chaque bille sur tous les apprêts, mais diffère des codes barres des cellules présents sur les autres billes. L’identificateur moléculaire unique diffère d’une amorce à l’autre et permet d’identifier les duplicatas de PCR3. Enfin, la séquence oligo-dT est responsable de la capture des ARNm polyadénaturés et de l’amorçage de la transcription inversée2.

Billes Oligo nucléotidiques avec code barre dans le cadre de la technologie du Drop-Sequencing

Lorsque des billes à codes-barres moléculaires sont appliquées dans le contexte du séquençage, elles permettent de tracer la séquence jusqu’aux cellules individuelles. La technologie Drop-Seq est un système expérimental à base microfluidique, dans lequel les billes étiquetées avec des oligonucléotides facilitent la récupération des transcriptomes unicellulaires.4 À l’aide d’un dispositif microfluidique, les cellules individuelles sont encapsulées avec des billes à code barre et un tampon de lyse dans des gouttelettes aqueuses. Après l’encapsulation, les cellules sont lysées, et l’ARNm est libéré et hybridé aux étiquettes oligonucléotidiques des billes. Par la suite, les gouttelettes sont regroupées et cassées, et les billes sont relâchées. Les ARNm unicellulaires capturés sur les billes isolées sont ensuite soumis à une transcription inversée avec changement de modèle. Les ADNc sont générés et amplifiés, et des adaptateurs de séquençage sont ajoutés. Enfin, les échantillons d’ARNm générés peuvent être séquencés.2,4  

Plus récemment, des méthodes pour l’identification et la correction des erreurs de codes-barres moléculaires sur les billes ont été identifiées, y compris la circularisation de la séquence d’ARN.5

Dans l’ensemble, la méthode Drop-Seq qui utilise des billes à codes-barres oligonucléotidiques,  analyse non seulement les transcriptions d’ARNm de milliers de cellules individuelles, mais enregistre également leurs cellules d’origine. Ainsi, la méthode permet une analyse transcriptomique monocellulaire à haut débit, ce qui facilite l’élucidation de la complexité biologique. 

Sources: 

1. Lobo, I. Biological complexity and integrative levels of organization. Nature Educ. 2008;1(1):141. 
2. Macosko EZ, Basu A, Satija R, Nemesh J, Shekhar K, Goldman M, Tirosh I, Bialas AR, Kamitaki N, Martersteck EM, Trombetta JJ, Weitz DA, Sanes JR, Shalek AK, Regev A, McCarroll SA. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter d Cell. 2015;161(5):1202-1214. 
3. Kivioja T, Vähärautio A, Karlsson K, Bonke M, Enge M, Linnarsson S, Taipale J. Counting absolute numbers of molecules using unique molecular identifiers. Nat Methods. 2011 Nov 20;9(1):72-74. 
4. https://www.dolomite-bio.com/how-it-works/drop-seq/ 
5. Tambe A, Pachter L. Barcode identification for single cell genomics. BMC Bioinformatics. 2019;20(1):32.