{"id":245,"date":"2021-07-29T17:10:59","date_gmt":"2021-07-29T17:10:59","guid":{"rendered":"https:\/\/galenvs.com\/?post_type=news-articles&p=245"},"modified":"2023-08-14T11:08:46","modified_gmt":"2023-08-14T11:08:46","slug":"introduction-exosomes-isolation","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/galenvs.com\/fr\/2021\/07\/29\/introduction-exosomes-isolation\/","title":{"rendered":"Introduction Isolement des exosomes"},"content":{"rendered":"\n

Que sont les Exosomes ?
<\/strong>Les exosomes sont des v\u00e9sicules extracellulaires qui contiennent plusieurs composants cellulaires, notamment des prot\u00e9ines, de l’ADN et de l’ARN. La fusion de la membrane plasmique avec des corps multiv\u00e9siculaires (MVB) produit des exosomes (Figure 1). Ces v\u00e9sicules sont principalement lib\u00e9r\u00e9es par une cellule pour communiquer ou interagir avec les cellules voisines en d\u00e9livrant des informations au sein de l’ADN et de plusieurs types d’ARN, par exemple, microARN, ARNm. De plus, la prot\u00e9ine contenue dans les exosomes peut interagir avec le processus cellulaire de la cellule r\u00e9ceptrice. Par cons\u00e9quent, il est important d’identifier les informations au sein de l’exosome pour \u00e9tudier le processus cellulaire. En particulier, la caract\u00e9risation de l’exosome devient une bonne technique pour \u00e9tudier le cancer m\u00e9tastatique (Zhu et al., 2020). Leurs biomarqueurs sp\u00e9cifiques aux cellules dont ils sont issus peuvent \u00e9galement \u00eatre utiles \u00e0 des fins de diagnostic (McNicholas et al., 2017).<\/p>\n\n\n\n

\"This<\/figure>\n\n\n\n

Figure 1 : Formation d’exosomes dans la cellule (Than, Guanzon, Leavesley et Parker, 2017).<\/p>\n\n\n\n

Plusieurs m\u00e9thodes peuvent \u00eatre utilis\u00e9es pour s\u00e9parer l’exosome d’un fluide corporel (Figure 2), tandis que la plupart des m\u00e9thodes de s\u00e9paration des exosomes sont bas\u00e9es sur la technique d’ultra-centrifugation (UC) (Brennan et al., 2020). Certaines des m\u00e9thodes d’isolement d’exosome sont r\u00e9sum\u00e9es ici :<\/p>\n\n\n\n

Isolation bas\u00e9e sur l’ultracentrifugation : les exosomes peuvent \u00eatre s\u00e9par\u00e9s par une s\u00e9rie de techniques de centrifugation, en \u00e9liminant les composants inutiles tels que les cellules et les d\u00e9bris cellulaires. Ces centrifugations fourniront un surnageant d’exosomes. Enfin, l’ultracentrifugation fournira un culot d’exosomes. Mais il est tr\u00e8s important de laver les exosomes granul\u00e9s avec des milieux de culture cellulaire ou du PBS au moins une fois pour les purifier. Il est \u00e9galement important d’effectuer toutes les \u00e9tapes de centrifugation \u00e0 4\u00b0C afin de maintenir les prot\u00e9ases, DNases et RNases inactives.<\/p>\n\n\n\n

Ultracentrifugation avec des gradients de densit\u00e9 de saccharose : Pour cette technique, le culot d’exosome sera ensuite centrifug\u00e9 \u00e0 100 000\u2013200 000 x G pendant 120 min dans un milieu \u00e0 gradient de saccharose. Les exosomes devraient flotter \u00e0 des densit\u00e9s de saccharose allant de 1,15 \u00e0 1,19 g\/mL sur des gradients continus de saccharose. Bien que cette m\u00e9thode fournisse un exosome hautement purifi\u00e9, elle prend du temps et demande beaucoup de travail. De plus, la configuration de la vitesse et du temps de centrifugation n\u00e9cessite des personnels tr\u00e8s exp\u00e9riment\u00e9s.<\/p>\n\n\n\n

\"This<\/figure>\n\n\n\n

Figure 2 : R\u00e9sum\u00e9 sch\u00e9matique de l’isolement des exosomes \u00e0 l’aide de cinq m\u00e9thodes diff\u00e9rentes \u00e0 partir de s\u00e9rum humain et d’analyses en aval. Avec Western blot (WB) ou analyse de suivi des nanoparticules (NTA) (Brennan et al., 2020).<\/p>\n\n\n\n

Ultracentrifugation en coussin (CUC) : l’\u00e9chantillon de s\u00e9rum doit \u00eatre dilu\u00e9 dans 4,6 ml de PBS et 0,4 ml de 40 % d’iodixanol-PBS pour une ultracentrifugation \u00e0 120 000 g pendant 2 heures \u00e0 4 \u00b0C. Apr\u00e8s centrifugations, le culot d’exosome n\u00e9cessite une remise en suspension dans 50 \u00e0 100 \u00b5l de PBS r\u00e9siduel pour CUC.<\/p>\n\n\n\n

Isolation bas\u00e9e sur la chromatographie d’exclusion de taille (SEC) : il s’agit d’une m\u00e9thode d’ultrafiltration plus rapide que l’ultracentrifugation, bien que les exosomes puissent s’agr\u00e9ger et obstruer les pores du gel, ce qui entra\u00eene un faible rendement. En outre, la contamination par l’ARN non exosomal est \u00e9galement un probl\u00e8me pour l’utilisation de cette technique. Par cons\u00e9quent, il n\u00e9cessite une \u00e9tape de lavage apr\u00e8s chaque \u00e9tape de filtration pour am\u00e9liorer la r\u00e9cup\u00e9ration des exosomes. Un concentrateur de nanofiltration pourrait \u00eatre utile pour un enrichissement rapide des exosomes avec de courtes p\u00e9riodes de centrifugation (Ludwig, Razzo, Yerneni et Whiteside, 2019).<\/p>\n\n\n\n

Isolation bas\u00e9e sur la pr\u00e9cipitation : les exosomes peuvent facilement pr\u00e9cipiter dans plusieurs solutions de polym\u00e8res excluant le volume, par exemple le poly\u00e9thyl\u00e8ne glycol. Si l’\u00e9chantillon incube pendant la nuit avec du poly\u00e9thyl\u00e8ne glycol \u00e0 4 \u00b0 C, la centrifugation \u00e0 basse vitesse fournit un culot d’exosome. De plus, les lectines pourraient \u00eatre utiles pour agglutiner les exosomes et les agglom\u00e9rer \u00e0 une vitesse centrifuge relativement faible (Chang, Chang, Chao et Yu, 2018).<\/p>\n\n\n\n

Isolement bas\u00e9 sur l’immuno-affinit\u00e9 : les exosomes contiennent un grand nombre de prot\u00e9ines, y compris des r\u00e9cepteurs cellulaires \u00e0 leur surface. Cela leur permet de se lier avec des anticorps sp\u00e9cifiques \u00e0 leurs aptam\u00e8res. Des anticorps sp\u00e9cifiques aux marqueurs de prot\u00e9ines exosomales, tels que Hsp70, CD9, CD63, CD81, CD82, Rab-5b et TSG101 sont utilis\u00e9s pour cette technique pour s\u00e9lectionner l’exosome souhait\u00e9 ou pour pi\u00e9ger l’exosome ind\u00e9sirable. Apr\u00e8s pi\u00e9geage de l’exosome avec un anticorps anti-marqueur sp\u00e9cifique, ces anticorps peuvent s’immobiliser sur des plaques ELISA, des billes magn\u00e9tiques et de chromatographie (Cai et al., 2018), ou les utiliser dans des dispositifs microfluidiques.<\/p>\n\n\n\n

En utilisant l’immunopartialit\u00e9 bas\u00e9e sur des billes magn\u00e9tiques, ces sous-ensembles peuvent \u00eatre sp\u00e9cifiquement captur\u00e9s et examin\u00e9s \u00e0 l’aide de la cytom\u00e9trie en flux ou \u00e9ventuellement de la microscopie \u00e9lectronique. Pour que les exosomes servent de marqueur, les v\u00e9sicules doivent \u00eatre am\u00e9lior\u00e9es et sp\u00e9cialement fractionn\u00e9es. Am\u00e9lioration des exosomes en grande partie r\u00e9alis\u00e9e par ultracentrifugation et r\u00e9guli\u00e8rement en m\u00e9lange avec l’inclinaison de l’\u00e9paisseur du saccharose. Il s\u00e9pare les sous-populations d’exosomes si elles sont pr\u00e9sentes. Les prot\u00e9ines CD9 et CD81 sont des marqueurs extracellulaires normaux qui peuvent \u00eatre utilis\u00e9s pour des captures sp\u00e9cifiques. Les billes de latex pour une capture sp\u00e9cifique n\u00e9cessitent plusieurs \u00e9tapes de centrifugation, ce qui pose un d\u00e9fi. Les billes magn\u00e9tiques de taille nanom\u00e9trique sont une alternative aux billes de latex pour la capture des exosomes, d\u00e9tachant une population plus homog\u00e8ne de v\u00e9sicules concernant<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"

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