Mois : juin 2021

La magnétofection, également connue sous le nom de transfection magnétique, est une procédure dans laquelle l’acide nucléique est lié aux nanoparticules magnétiques (MNP) suivies de leur livraison dans les cellules eucaryotes par l’application de la force magnétique. Les nanoparticules magnétiques sont habituellement constituées d’oxyde de fer et dégradées dans les cellules vivantes, ne présentant donc aucun danger pour les cellules. Cette technique a des applications plus larges dans la recherche moléculaire, la biologie cellulaire et les applications thérapeutiques potentielles (1).

Comment fonctionne la magnétofection

Dans la magnétofection, les acides nucléiques sont d’abord liés aux MNP, suivis de leur distribution dans les cellules eucaryotes à l’aide d’un champ magnétique. La liaison des acides nucléiques [acide désoxyribonucléique (ADN) et acide ribonucléique (ARN)] aux MNP est facilitée par des interactions électrostatiques. L’ADN et l’ARN ont des charges de surface négatives et sont attirés vers des matériaux positifs (cationiques) à la surface des MNP. Les expériences in vitro et in vivo ont prouvé que les molécules d’acide nucléique liées aux MNP sont transférées à l’intérieur de la cellule par magnétofection de manière très efficace (2).

Avantages de la magnétofection par rapport aux autres méthodes de transfection

La transfection est une procédure pour délivrer des acides nucléiques à l’intérieur des cellules eucaryotes en utilisant des méthodes physiques ou chimiques. Le transfert d’acides nucléiques par vecteurs viraux dans les cellules est classé comme transduction; cependant, leur distribution est parfois assurée par des méthodes de transfection. La magnétofection, y compris plusieurs autres méthodes comme la microinjection, la sonoporation, l’électroporation, le pistolet à gènes, la nucléosection, les micronésules et la magnétoporation, entrent dans la catégorie des méthodes physiques. Les méthodes de transfection chimique sont principalement à base de lipides ou de polymères. Plusieurs modifications des méthodologies chimiques telles que les nanoparticules, les points quantiques et l’administration d’acide nucléique à médiation graphène avec des nanoparticules de silice ou des nanotubes de carbone sont également utilisées dans certains protocoles. Cependant, parmi toutes ces méthodes, la magnétofection est relativement plus simple d’utilisation, efficace dans la livraison d’acide nucléique et économique par rapport à toutes les autres méthodologies qui impliquent des équipements sophistiqués et des formulations complexes.

La livraison d’acides nucléiques libres ou de gènes thérapeutiques contenant des vecteurs dans les cellules/tissus eucaryotes est assez difficile. Dans les environnements intracellulaires, les enzymes dégradantes empêchent l’apport de matériel génétique thérapeutique à l’intérieur des cellules/tissus. La magnétofection a été reconnue comme l’un des outils les plus puissants pour fournir des acides nucléiques intacts/fonctionnels et des vecteurs contenant du matériel génétique spécifique utilisé, ayant ainsi le potentiel de corriger le gène dysfonctionnel (3).

Supposons que la magnétofection est utilisée pour la livraison de l’ARN. Dans ce cas, il devrait être transféré dans le cytoplasme cellulaire pour l’expression. En revanche, l’ADN pénètre d’abord dans le noyau, puis forme l’ARN messager qui sort vers le cytoplasme pour exprimer le produit désiré.

Plusieurs rapports scientifiques ont fourni une preuve de concept sur la supériorité de la magnétofection par rapport à d’autres procédures de transfection. Selon une étude in vitro de transfert de gène dans les cellules microgliales qui protègent notre cerveau, la magnétofection a transféré efficacement le matériel génétique par rapport aux méthodologies conventionnelles de transfert de gène (4).

Progrès récents en matière de magnétofection :

La magnétofection a de nombreuses applications dans les protocoles de thérapie génique dans lesquels les gènes défectueux sont remplacés par des gènes sains dans les cellules/tissus humains. Par rapport à d’autres protocoles, la transmission de gènes saints par magnétofection dans les cellules humaines est considérée comme la plus prometteuse. Cependant, des recherches sont en cours pour développer une formulation appropriée et des compétences appropriées en matière de champ magnétique. La thérapie génique par magnétofection à des fins thérapeutiques en plus de l’administration ciblée offre l’avantage unique d’être moins invasive (5).

Le transfert d’acide nucléique par nanoparticules magnétiques dans les cellules souches (6) et la souplesse de la méthodologie (7) ajoutent à sa polyvalence pour son utilisation extensive en médecine régénérative et en maladies génétiques.

La magnétofection dans la pratique clinique

Il est devenu un fait que la magnétofection, si elle est correctement utilisée, pourrait transférer efficacement des acides nucléiques ainsi que des gènes thérapeutiques contenant des vecteurs viraux dans les cellules/tissus humains. Cependant, son développement pour l’utilisation clinique est entravé en raison de la nature chimique du devenir des MNP in vivo. Des recherches sont en cours sur la bioévaluation des MNP pour leur utilisation clinique potentielle dans les protocoles de thérapie génique impliquant la magnétofection (8). En ce qui concerne les applications cliniques de la magnétofection, l’administration ciblée dans les tissus cancéreux pour contrôler plusieurs types de cancer est très prometteuse (9).

Sources:

1. Plank C, Anton M, Rudolph C, Rosenecker J, Krotz F. Enhancing and targeting nucleic acid delivery by magnetic force. Expert Opin Biol Ther. 2003;3(5):745-58.
2. Bi Q, Song X, Hu A, Luo T, Jin R, Ai H, et al. Magnetofection: Magic magnetic nanoparticles for efficient gene delivery. Chinese Chemical Letters – doi: https://doiorg/101016/jcclet202007030. 2020.
3. Scherer F, Anton M, Schillinger U, Henke J, Bergemann C, Kruger A, et al. Magnetofection: enhancing and targeting gene delivery by magnetic force in vitro and in vivo. Gene Ther. 2002;9(2):102-9.
4. Smolders S, Kessels S, Smolders SM, Poulhes F, Zelphati O, Sapet C, et al. Magnetofection is superior to other chemical transfection methods in a microglial cell line. J Neurosci Methods. 2018;293:169-73.
5. Qunjie B, Song X, Hu A, Luo T, Jin R, Ai H, et al. Magnetofection: Magic magnetic nanoparticles for efficient gene delivery[J]. . Chinese Chemical Letters. 2020;31(12):3041-6.
6. Yamoah MA, Thai PN, Zhang X. Transgene Delivery to Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Nanoparticles. Pharmaceuticals. 2021;14(4):334.
7. Blokpoel Ferreras LA, Chan SY, Vazquez Reina S, Dixon JE. Rapidly Transducing and Spatially Localized Magnetofection Using Peptide-Mediated Non-Viral Gene Delivery Based on Iron Oxide Nanoparticles. ACS Appl Nano Mater. 2021;4(1):167-81.
8. Dragar C, Kralj S, Kocbek P. Bioevaluation methods for iron-oxide-based magnetic nanoparticles. Int J Pharm. 2021;597:120348.
9. Belete TM. The Current Status of Gene Therapy for the Treatment of Cancer. Biologics. 2021;15:67-77.

La complexité biologique et les défis liés à son élucidation

Les organismes biologiques sont des systèmes complexes composés de divers types de cellules et de tissus.¹ Pour élucider les processus physiologiques et physiopathologiques qui se produisent dans les systèmes biologiques, les études de recherche devraient tenir compte de leur complexité. Cependant, de nombreux paradigmes expérimentaux traditionnels ne permettent pas d’évaluer correctement cette complexité biologique ou ne permettent pas une évaluation rapide et évolutive. Les billes magnétiques à code-barre moléculaire sont l’une des pistes de recherche sur cette complexité biologique.

Les billes à codes-barres moléculaires et leurs applications

Les billes à code-barres moléculaires sont étiquetées avec des codes uniques (molécules) qui permettent l’évaluation à une seule cellule. Le nombre de codes varie en fonction du test utilisé et peut inclure le marquage fluorescent, chimique, électronique ou graphique. Les billes à codes-barres moléculaires facilitent l’identification des lectures provenant de cellules individuelles. Dans le contexte des systèmes microfluidiques, elles permettent la flexibilité, la sensibilité et l’analyse à haut débit. Par conséquent, les billes à codes barres ont trouvé des applications dans les essais biologiques multiplex dans les domaines du diagnostic moléculaire, du développement de biomarqueurs, de l’analyse de l’hétérogénéité tumorale, de la pharmacogénomique, de la compréhension de la complexité des tissus et de l’analyse mutationnelle des gènes. 

Billes à code barres oligonucléotidiques

Les oligonucléotides sont l’un des types de codes-barres moléculaires des billes. Macosco et al. (2015) ont décrit la conception des billes oligonucléotidiques à code à barres utilisées avec la méthode de Drop-Seq. ² Les auteurs ont synthétisé des amorces oligonucléotidiques sur les billes dans la direction 5 à 3, ce qui laisse libre trois extrémités disponibles pour l’amorçage enzymatique. Les étiquettes d’oligonucléotides se composent de quatre parties : une séquence constante, un « code-barre de cellules », un identificateur moléculaire unique et une séquence de capture et d’amorçage d’oligo-dT. La séquence constante sert de site d’amorçage pour la PCR en aval et le séquençage. Le « code barre des cellules » est identique à la surface de chaque bille sur tous les apprêts, mais diffère des codes barres des cellules présents sur les autres billes. L’identificateur moléculaire unique diffère d’une amorce à l’autre et permet d’identifier les duplicatas de PCR3. Enfin, la séquence oligo-dT est responsable de la capture des ARNm polyadénaturés et de l’amorçage de la transcription inversée2.

Billes Oligo nucléotidiques avec code barre dans le cadre de la technologie du Drop-Sequencing

Lorsque des billes à codes-barres moléculaires sont appliquées dans le contexte du séquençage, elles permettent de tracer la séquence jusqu’aux cellules individuelles. La technologie Drop-Seq est un système expérimental à base microfluidique, dans lequel les billes étiquetées avec des oligonucléotides facilitent la récupération des transcriptomes unicellulaires.4 À l’aide d’un dispositif microfluidique, les cellules individuelles sont encapsulées avec des billes à code barre et un tampon de lyse dans des gouttelettes aqueuses. Après l’encapsulation, les cellules sont lysées, et l’ARNm est libéré et hybridé aux étiquettes oligonucléotidiques des billes. Par la suite, les gouttelettes sont regroupées et cassées, et les billes sont relâchées. Les ARNm unicellulaires capturés sur les billes isolées sont ensuite soumis à une transcription inversée avec changement de modèle. Les ADNc sont générés et amplifiés, et des adaptateurs de séquençage sont ajoutés. Enfin, les échantillons d’ARNm générés peuvent être séquencés.2,4  

Plus récemment, des méthodes pour l’identification et la correction des erreurs de codes-barres moléculaires sur les billes ont été identifiées, y compris la circularisation de la séquence d’ARN.5

Dans l’ensemble, la méthode Drop-Seq qui utilise des billes à codes-barres oligonucléotidiques,  analyse non seulement les transcriptions d’ARNm de milliers de cellules individuelles, mais enregistre également leurs cellules d’origine. Ainsi, la méthode permet une analyse transcriptomique monocellulaire à haut débit, ce qui facilite l’élucidation de la complexité biologique. 

Sources: 

1. Lobo, I. Biological complexity and integrative levels of organization. Nature Educ. 2008;1(1):141. 
2. Macosko EZ, Basu A, Satija R, Nemesh J, Shekhar K, Goldman M, Tirosh I, Bialas AR, Kamitaki N, Martersteck EM, Trombetta JJ, Weitz DA, Sanes JR, Shalek AK, Regev A, McCarroll SA. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter d Cell. 2015;161(5):1202-1214. 
3. Kivioja T, Vähärautio A, Karlsson K, Bonke M, Enge M, Linnarsson S, Taipale J. Counting absolute numbers of molecules using unique molecular identifiers. Nat Methods. 2011 Nov 20;9(1):72-74. 
4. https://www.dolomite-bio.com/how-it-works/drop-seq/ 
5. Tambe A, Pachter L. Barcode identification for single cell genomics. BMC Bioinformatics. 2019;20(1):32.